Kamuya açık veri analizi
SARS-CoV-2 soyları ve örneğin Şili'den elde edilen dizilerden alındığı tarih hakkındaki veriler, şu adreste bulunan Consorcio Genomas CoV2 sitesinden elde edilmiştir: https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Aşılama verileri, Bilim, Teknoloji, Bilgi ve Yenilik Bakanlığı'nın şu adreste bulunan kamuya açık verilerinden elde edilmiştir: https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Ürün 83).
Enfektivite deneyi
Farklı SARS-CoV-2 spike proteinlerini taşıyan psödotipli virüsler, daha önce tanımladığımız gibi hazırlandı.12. Kısaca, HIV-1 bazlı SARS-CoV-2 psödotipleri, HEK293T hücrelerinde pNL4.3-ΔEnv-Luc'un karşılık gelen pCDNA-SARS-CoV-2 Spike kodlama vektörüyle birlikte 1:1 molar oranda transfekte edilmesiyle üretildi. Endoplazmik retikulumda tutulmayı önlediği bilinen C-terminal ucunun (SΔ19) son 19 amino asidini içermeyen, kodon optimizasyonlu bir spike'ı kodlayan plazmitler12 gen sentezi veya özelleştirilmiş bölgeye yönelik mutajenez (GeneScript) yoluyla elde edildi ve aşağıdaki mutasyonları içeriyordu: soy A (referans dizisi), soy B (D614G), soy B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), soy P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) ve soy C.37 (G75V, T76I, Δ246 252- 452, L490Q, F614S, D859G, T3,000N). Her psödotip preparatı, oda sıcaklığında 1 rpm'de santrifüjleme yoluyla temizlendi, HIV-24 Gag p50 Quantikine ELISA Kiti (R&D Systems) kullanılarak ölçüldü, %80 fetal sığır serumu (Sigma-Aldrich) içinde bölüntülere ayrıldı ve 1 °C'ye kadar -24 °C'de saklandı. kullanmak. HEK-ACE2 hücrelerini enfekte etmek için farklı miktarlarda psödotipli virüsler (HIV-48 p96 proteininin seviyeleri ile belirlendiği şekilde) kullanıldı ve XNUMX saat sonra ateş böceği lusiferaz aktivitesi, Glomax XNUMX Mikroplakada Lusiferaz Tahlili Reaktifi (Promega) kullanılarak ölçüldü. lüminometre (Promega).
nötralizasyon testi
Psödotipli virüs nötralizasyon deneyleri esasen daha önce tanımladığımız gibi gerçekleştirildi12. Kısaca, plazma örneklerinin (1:4 ila 1:8748) seri seyreltmeleri, %10 fetal sığır serumu ile DMEM'de hazırlandı ve her psödotipli virüsün 5 ng p24'ü ile 1 °C'de 37 saat boyunca ve ardından 1x10'da inkübe edildi.4 Her kuyucuğa HEK-ACE2 hücreleri eklendi. Psödotipli virüsle (A soyu) inkübe edilen HEK293T hücreleri (ACE2'yi eksprese etmeyen) negatif kontrol olarak kullanıldı. Hücreler 48 saat sonra lize edildi ve ateş böceği lusiferaz aktivitesi, bir Glomax 96 Mikroplaka lüminometrede (Promega) Lusiferaz Tahlili Reaktifi (Promega) kullanılarak ölçüldü. Her seyreltme için nötrleştirme yüzdesi hesaplandı ve her numunenin ID50'si, GraphPad Prism versiyon 9.0.1 kullanılarak hesaplandı.
İstatistiksel analizler
İstatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımının 9.1.2 sürümü kullanılarak yapıldı. SARS-CoV-2 psödotipli virüslerden oluşan bir panele karşı antikor titrelerini (NAbT'ler) nötralize etmek için çoklu grup karşılaştırmalarının yanı sıra cinsiyet ve sigara içme durumuna göre NAb yanıtlarının karşılaştırmaları, eşleştirilmiş bir Wilcoxon işaretli sıralı test kullanılarak gerçekleştirildi. Faktör değişimi, ID'deki geometrik ortalama titre farkı olarak hesaplandı.50 Yabani tip psödotipli virüsünkiyle karşılaştırıldığında. NAbT'ler ile yaş veya BMI arasındaki korelasyon analizi Spearman testi kullanılarak yapıldı. Enfektivitenin istatistiksel analizi için tek yönlü ANOVA ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı. p değerinin ≤0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Etik onay
Çalışma protokolü, Universidad de Chile Tıp Fakültesi Etik Kurulu (Projeler N° 0361-2021 ve N° 096-2020) ve Clínica Santa Maria (Proje N°132604-21) tarafından onaylandı. Tüm bağışçılar bilgilendirilmiş onamı imzaladı ve örnekleri anonimleştirildi.
Lambda varyantındaki spike mutasyonlarının enfektivite ve nötralize edici antikor tepkileri üzerindeki etkisi
3695 Haziran'a göre GISAID'de saklanan Şili'den 24 sekansın analizith 2021, son üç aylık dönemde SARS-CoV-2 varyantları Gamma ve Lambda'nın açık bir baskınlığını gösteriyor ve birlikte tüm dizilerin %79'unu oluşturuyor.
İlginç bir şekilde, bu dönem, 65.6 Haziran itibarıyla hedef nüfusun %18'sının (27 yaş ve üzeri bireyler) eksiksiz bir aşılama planı aldığı büyük bir aşılama kampanyasıyla karakterize edilmiştir.th 2021
Tam bir şemayla aşılanan kişilerin %78.2'sinin Sinovac Biotech'ten inaktive edilmiş virüs aşısı CoronaVac'ı aldığı göz önüne alındığında, Lambda varyantında mevcut spike mutasyonlarının bu aşının ortaya çıkardığı antikorların nötralizasyon kapasitesi üzerindeki etkisini araştırmaya çalıştık.
Bunun için, Wuhan-1 referans soyundan (Vahşi tip; A soyu), D2G mutasyonundan (B soyu) ve Alfa'dan (B soyu) spike proteinini taşıyan HIV-1 bazlı SARS-CoV-614 psödotipli virüsler ürettik. .1.1.7), Gama (soy P.1) ve Lambda (soy C.37) varyantları.
Virüs hazırlığı sırasında, Lambda spike proteini tarafından yönlendirilen artan enfektiviteyi gösteren D614G mutantı veya Alfa ve Gama varyantları ile karşılaştırıldığında, Lambda spike'ı taşıyan psödotipli virüsle enfekte olmuş hücrelerin önemli ölçüde daha yüksek biyolüminesans değerleri ürettiğini sürekli olarak gözlemledik.
Şekil 1.Farklı başak proteinlerinin aracılık ettiği enfeksiyon.
(A) SARS-CoV-2 spike proteininin ve bu çalışmada kullanılan varyantların şematik gösterimi. Soylar parantez içinde belirtilmiştir. RBD, reseptör bağlanma alanı, CM; sitoplazmik kuyruk.
(B) Her soyun psödotiplerinin eşdeğer miktarlarda HIV-1 p24 kullanılarak titrasyonu. Ateş böceği lusiferaz aktivitesi, enfeksiyondan 48 saat sonra göreceli lüminesans birimleri (RLU) olarak ölçüldü. Ortalama ve SD, temsili bir üçlü deneyden hesaplandı.
Daha sonra, Universidad de Chile ve Santiago, Şili'deki Clínica Santa María'dan sağlıklı sağlık çalışanlarından alınan 79 plazma örneğini kullanarak nötralizasyon analizleri gerçekleştirmek için yukarıda bahsedilen psödotipli virüsleri kullandık.
ID4 titresini hesaplayamadığımız için 50 örneği hariç tuttuk. Analiz edilen örneklerin %73'ü kadınlara, ortalama yaşları 34'e (IQR 29 – 43) ve vücut maksimum indeksi (BMI) 25'e (IQR 22.7 – 27) karşılık geliyordu. Aşılama süresi devam ederken katılımcıların %20.5'i aktif sigara içtiğini beyan etti. Örnekler, CoronaVac aşısının ikinci dozundan ortalama 95 gün sonra (IQR 76 – 96) alındı.
Yabani tip başak proteinini taşıyan psödotipli virüsün nötralizasyonunun %50'lik bir inhibitör seyreltme (ID) ile sonuçlandığını gözlemledik.50) ortalama titre 191.46 (154.9 – 227.95, %95 GA), 153.92 (115.68 – 192.16, %95 GA), 124.73 (86.2 – 163.2, %95 GA), 104.57 (75.02 – 134.11, %95) CI ) ve 78.75 (49.8 – 107.6, %95 CI), D614G mutantından veya Alfa, Gama ve Lambda varyantlarından spike proteinini taşıyan psödotiplenmiş virüsler için sırasıyla.
Ayrıca ID'nin geometrik ortalama titresinin de olduğunu gözlemledik.50 titreler Lambda spike'ı taşıyan psödotiplenmiş virüs için 3.05 (2.57 – 3.61, %95 CI), Gama spike'ı için 2.33 (1.95 – 2.80, %95 CI), 2.03 (1.71 – 2.41, %95 CI) faktör azaldı Wild tipi ani artışla karşılaştırıldığında Alfa ani yükselişi için 1.37 (1.20 – 1.55, %95 CI).
Çalışma grubumuzda cinsiyet, yaş, vücut kitle indeksi (BMI) veya sigara içme durumu ile nötralize edici antikor titreleri arasında herhangi bir korelasyon gözlenmedi.
Şekil 2.CoronaVac aşılarından alınan plazma örnekleri kullanılarak nötralizasyon testi
(A) Karşılıklı %50 nötralizasyon titresindeki değişiklikler (ID50) D75G (B soyu), Alfa (B.614 soyu) karşı CoronaVac aşısı yapılan 1.1.7 alıcıdan alınan plazma örneklerinde,
Yabani tip virüsle karşılaştırıldığında Gama (soy P.1) ve Lambda (soy C.37) varyantları. Sonuçlar, eşleşen numunelerin nötralizasyon titrelerindeki fark olarak gösterilir. Kimlik karşılaştırması için P değerleri50 Wilcoxon işaretli sıra testi ile hesaplanır.
(B) Kutu grafikleri ID'nin medyan ve çeyrekler arası aralığını (IQR) gösterdi50 her psödotipli virüs için. Faktör değişiklikleri ID'deki geometrik ortalama titre farkı olarak gösterilir50 Yabani tip psödotipli virüsle karşılaştırıldığında. İstatistiksel analizler Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler işaretli sıra testi kullanılarak yapıldı.
Birlikte, verilerimiz, Şili ve Güney Amerika ülkelerinde yüksek oranda dolaşan, yeni tanınan ilgi konusu Lambda varyantının spike proteininin, artan enfektivite ve CoronaVac tarafından ortaya çıkan nötrleştirici antikorlardan kaçma yeteneği sağlayan mutasyonlar taşıdığını ortaya çıkardı.
